Cromatografía de fase normal

   A cromatografía de fase normal ou "Normal phase HPLC" (NP-HPLC) foi o primeiro tipo de sistema HPLC utilizado no campo da química, e caracteriza-se por separar os compostos em base a seu polaridad. Esta técnica utiliza uma fase estacionária polar e uma fase móvel apolar, e utiliza-se quando o composto de interesse é bastante polar. O composto polar associa-se e é retido pela fase estacionária. A força de absorción aumenta à medida que aumenta a polaridad do composto e a interacção entre o composto polar e a fase estacionária polar (em comparação à fase móvel) aumenta o tempo de retenção.

   A força de interacção não só depende dos grupos funcionais do composto de interesse, senão também em factores estericos de forma que os isómeros estruturais com frequência se podem diferenciar o um do outro. A utilização de disolventes mais polares na fase móvel diminui o tempo de retenção dos compostos enquanto os disolventes mais hidrofóbicos tendem a aumentar o tempo de retenção.

  A NP-HPLC caiu em desuso aos anos setenta com o desenvolvimento do HPLC de fase reversa ou Reversed-phase HPLC devido à falta de reproductibilidad dos tempos de retenção já que os disolventes próticos mudavam o estado de hidratación da silica ou alúmina da cromatografía.

 Cromatografía de fase reversa

   A HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste em uma fase imóvel apolar e uma fase móvel de polaridad moderada. Uma das fases estacionárias mais comuns deste tipo de cromatografía é a silica tratada com RMe₂SiCl, onde o R é uma corrente alquil tal como C₁₈H₃₇ou C₈H₁₇. O tempo de retenção é maior para as moléculas de natureza apolar, enquanto as moléculas de carácter polar eluyen mais rapidamente.

   O tempo de retenção aumenta com a adição de disolvente apolar à fase móvel e diminui com a introdução de disolventes mas hidrofobicos. A cromatografía de fase reversa é tão utilizada que com frequência lho denomina HPLC sem nenhuma especificação adicional. A cromatografía de fase reversa baseia-se no princípio das interacções hidrofóbicas que resultam das forças de repulsión entre um disolvente relativamente polar, um composto relativamente apolar, e uma fase estacionária apolar. A força condutora na união do composto à fase estacionária é a diminuição da área do segmento apolar do analito exposto ao disolvente.Este efeito hidrofóbico está dominado pela diminuição da energia livre da entropía sócia com a minimización da interfase composto-disolvente polar. O efeito hidrofóbico diminui com a adição de disolvente apolar à fase móvel. Isto modifica o coeficiente de partição de forma que o composto se move pela coluna e eluye.

   As características do composto de interesse jogam um papel muito importante na retenção. Em general, um composto com uma corrente alquil longa associa-se com um tempo de retenção maior porque aumenta a hidrofobicidad da molécula. Ainda assim, as moléculas muito grandes podem ver reduzida a interacção entre a superfície do composto e a fase estacionária. O tempo de retenção aumenta com a área de superfície hidrofóbica que costuma ser inversamente proporcional ao tamanho do composto. Os compostos ramificados costumam eluir mais rapidamente que seus isómeros lineares já que a superfície total se vê reduzida.

   Aparte da hidrofobicidad da fase móvel, outras modificações da fase móvel podem afectar a retenção do composto; por exemplo, a adição de sais inorgánicas provoca um aumento linear na tensão superficial, e como que a entropía da interfase composto-disolvente está controlada precisamente pela tensão superficial, a adição de sais tende a aumentar o tempo de retenção.

   Outra variável importante é o pH já que pode mudar a hidrofobicidad do composto. Por este motivo, a maioria de métodos utilizam umtampón como o fosfato de sodio para controlar o valor do pH. Estes tampones controlam o pH, mas também neutralizam o ónus ou qualquer resto de silica da fase estacionária que tenha ficado exposta e actuam como contraiones que neutralizam o ónus do composto. O efeito dos tampones sobre a cromatografía pode variar, mas em general melhoram a separação cromatográfica.

   As colunas de fase reversa jogam-se a perder com menor facilidade que as colunas de silica normais. Ainda assim, muitas colunas de fase reversa estão formadas por silica modificada com correntes alquil e não se devem utilizar nunca com bases em médio acuoso já que estas poderiam danificar o esqueleto de silica subjacente. As colunas podem-se utilizar em ácidos em médio acuoso mas não deveriam estar expostas demasiado tempo ao ácido porque pode corroer as partes metálicas do aparelho de HPLC.